Combined Bio．Process for Treatment of M unicipal W astewater Containing CU ’
WU Xiao-lin，W ANG Lei，GAO Yan，SU Yao—dong，LI Feng—ting
(1．Department of Chemistry，Tongji University，Shanghai 200092，China；2．State Key Lab of Pollution Control& Resource Reuse，Tongji University，Shanghai 200092，China；3．Wuhan Designing Institute of China Light Industry，Wuhan 430063，China)

Abstract：A combined bioprocess consisting of biosorption section with P．putida 5一x cell as biosorbent followed by a SBR is deve1． oped tO treat Cu²⁺ containing municipal wastewater．The optimal preparing technique of P．putida 5-X cell as biosorbent is studied． Under the optimal condition．a(chǎn)dsorption capacity of the P．putida 5-X cell tO Cu reached 87．3 mg·g^-1．The performance of the combined bioprocess for treating Cu²⁺ containing wastewater is asses,sad．The experimental results indicate that after trea tment by the biosorption section，the Cu²⁺ concentration in wastewater reduced to the level that did not inhibit COD removal efficiency of subsequent SBR activated sludge process．a(chǎn)lthough it still affectes the COD adsorption capacity of activated sludge．In terms of COD removal，the biosorption section is efficient for reducing Cu²⁺ concentration to provide biodegradable wastewater for subsequent SBR activated sludge proc ess．
Key words：cell growth phase；cell pretreatment；removal of COD；COD adsorbing capability；Cu²⁺ adsorbing；Pseudomonas putida

　　 Cu²⁺是工業(yè)廢水中最常見的重金屬離子之一，研究表明，當污水中Cu²⁺濃度達到1.0mg·L^-1以上時，活性污泥系統(tǒng)中微生物的生長就開始受到影響，達到10mg·L^-1以上時，微生物生長受到明顯抑制^[1,2]．因此，在進入活性污泥過程前，應(yīng)將Cu²⁺濃度降到1.0mg·L^-1或更低^[3]．
　　廢水中重金屬離子的傳統(tǒng)處理方法有化學(xué)沉淀、離子交換、電化學(xué)法等．這些處理方法都有明顯缺點，尤其當重金屬離子濃度較低時(100mg·L^-1以下)，如去除不完全、處理劑消耗量大、產(chǎn)生環(huán)境有害污泥及成本高等，且加入的化學(xué)試劑將嚴重影響后續(xù)活性污泥的活性^［4］．近20年來，利用某些具有高吸附能力的微生物細胞從廢水中吸附重金屬離子的方法引起了人們的廣泛關(guān)注，據(jù)報道，一些細菌、酵母菌、真菌和藻類等都可作為廢水中的Cu²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺ ，Zn²⁺ 等金屬離子的吸附劑^[5-8]．在以前的研究中，篩選1株革蘭氏陰性細菌Pseudomonas putida 5-x，研究表明該細菌對Cu²⁺和Ni²⁺有較高吸附能力^[9,10]，可以作為生物吸附劑用于從廢水中吸附回收重金屬離子．
　　本文介紹了進一步提高P．putida 5-x細胞吸附能力的細胞制備技術(shù)，并研究了其在生物吸附一生物降解組合系統(tǒng)處理含Cu²⁺廢水時，對Cu²⁺的去除能力，以及殘余的Cu²⁺對隨后的SBR系統(tǒng)降解有機污染物的影響，并和單一的SBR處理含Cu²⁺廢水作了比較．
1 材料和方法
1．1 Pseudomonas putida 5-x細胞吸附劑的制備和再生
　　本實驗所用的生物吸附劑為電鍍廠廢水中分離出的革蘭氏陰性細菌Pseudomonas putida 5-x(圖1)，該細菌具有較高的重金屬離子吸附能力．將其接種到50mL LB培養(yǎng)基中，30℃ ，200r／min搖床培養(yǎng)24h．隨后以1％的接種量接種于5種不同的培養(yǎng)基中(表1)．于30℃ ，200r／min搖床培養(yǎng)12～48h．將培養(yǎng)液在4℃ ，4 000 r／min離心分離10min得到菌體，用100 mL pH為6．0的10mol·L^-1MES緩沖液洗2次．預(yù)處理方法為每100mg P．putida 5-x細胞用25mL不同的洗滌液于25℃ ，200r／min振蕩洗滌30min，再用50mL pH為6．0的10mol·L^-1MES緩沖液洗滌．再生方法同預(yù)處理方法．

表1 5種培養(yǎng)基的配方
Table 1 Composition of five culture mediums

成分／g·L^-1 硫限制培養(yǎng)基 氨限制培養(yǎng)基 磷限制培養(yǎng)基 碳限制培養(yǎng)基 無營養(yǎng)限制培養(yǎng)基 Tris 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 NH₄Cl 1.5 0.15 1.5 1.5 1.5 K₂HP0₄ 1.5 1.5 0.1 1.5 1.5 NaCl 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 K₂S0₄ 0 1.0 1.0 1.0 1.0 KCl 1.0 0 0 0 0 MgS04·7H2O 0 0.2 0.2 0.2 0.2 MgCl2·6H2O 0.2 0 0 0 0 CaCl2·2H2O 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 FeSO4·7H2O 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 D—Glueose 10 10 10 1.5 10 Yeast Extract 0.1 0.1

0.1

0.1 0.1

1．2 透視電鏡(TEM)分析
　　處理后的細胞經(jīng)離心，乙醇脫水后，固定在Spurr介質(zhì)上，切成厚度為60nm 的薄片，進行透射電鏡分析．使用電鏡為JEM一1200EX—II(JEOL，日本)．
1．3 吸附．降解組合生物系統(tǒng)及其操作
　　實驗室所用的組合生物系統(tǒng)包括1個半連續(xù)生物吸附裝置和1個序批式反應(yīng)器(SBR)．生物吸附裝置由2個吸附槽、1個再生槽和1個洗滌槽組成．每個吸附槽容積為１L，內(nèi)有磁子進行磁力攪拌．廢水與生物吸附劑以對向的方式進入，即600mL含銅離子城市污水首先進入第1個吸附槽中，經(jīng)20min攪拌吸附后靜置10min，上清液進入第2個吸附槽進行二次吸附一沉淀操作，二次吸附后的上清液進入SBR反應(yīng)器進行活性污泥法處理以去除COD．生物吸附劑首先進入第2個吸附槽中，經(jīng)過一次吸附一沉
淀操作后再進入第1個吸附槽用于吸附，飽和后轉(zhuǎn)入再生槽進行再生，再生后的吸附劑再進入第2個吸附槽，以此類推(見圖2)．SBR的容量為3L，設(shè)計MLVSS為2000～3000mg·L^-1 ，運行周期為8h，包括4步：進水(10min，2L)；反應(yīng)(6.5 h)；靜置(1.0h)；排出(20min，2L)．
　　實驗所配含各種Cu 濃度的城市污水的COD為800mg·L^-1左右．
1．4 Cu 吸附等溫線
　　取一定體積含Cu²⁺城市污水， Cu²⁺濃度分別為10mg·L^-1 ，25mg·L^-1 ，30mg·L^-1，50mg·L^-1，加入0．5g·L^-1 生物吸附劑．測定吸附后污水中殘留的Cu²⁺濃度，計算生物吸附劑對Cu²⁺的吸附容量，并繪制Cu²⁺的吸附等溫線．
1．5 分析方法
　　細胞干重的測定：取100mL 培養(yǎng)液，經(jīng)4 000r／min離心20min得到菌體，用蒸餾水洗滌2次，于80℃ 烘干至恒重，用電子天平稱重．
　　培養(yǎng)液中的細胞生長情況通過測定培養(yǎng)液的OD₆₀₀值確定．用Perkin Elmer 3300原子吸收儀測定Cu²⁺的濃度．根據(jù)APHA標準法測定COD和MLVSS^[11]．Cu²⁺的吸附容量根據(jù)下式計算：
　　Q-(C_i—C_e)V／W
　　Q 為Cu²⁺的吸附能力(mg·g^-1)；C_i為污水中Cu²⁺的初始濃度(mg·L^-1)；C_e為吸附后上清液中Cu²⁺的濃度(mg·L^-1)；W 為細胞干重(g)；V為緩沖液體積(L)．

2 結(jié)果和討論
2．1 培養(yǎng)基成分對P．putida 5一X細胞吸附能力的影響
　　本研究中，使用了5種培養(yǎng)基培養(yǎng)P．putida　5一X細胞，并測定不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的P．putida 5一X細胞吸附銅離子的能力．表2可見，硫和氮限制的培養(yǎng)基中生長的P．putida 5－X細胞對Cu²⁺的吸附能力顯著提高．但培養(yǎng)基中氮含量低時P．putida 5一X生長速度較慢，故使用硫限制培養(yǎng)基培養(yǎng)P．putida 5-x細胞是最佳選擇．以后的研究中細胞培養(yǎng)均采用硫限制培養(yǎng)基．
　　完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞中C，N，P，S的比例有一個相對固定值，一般細胞的C：N：P：S約為50：14：3：1^[11]．當培養(yǎng)基中硫和氮含量低時，細胞缺少S源或N源，正常合成和代謝功能受到限制，而細胞吸收的過量C源、P源不能加入正常的細胞生長代謝，只能合成為生長和代謝非必需的含碳和含磷的多糖和聚磷酸類化合物并儲存在細胞內(nèi)^[12]．多糖中的羰基和多磷酸鹽中的膦酸脂都帶有負電荷，是細胞表面吸附重金屬的功能基團．所以在N和S限制培養(yǎng)基中生長的細胞表面組分中多糖和聚磷酸鹽含
量較高，因此細胞吸附重金屬的能力也顯著提高．
2．2 細胞生長周期對吸附能力的影響
　　在硫限制培養(yǎng)基中，P．putida 5－X的生長可分為4個階段：停滯期(0～8h)，對數(shù)增長期(10～24h)，穩(wěn)定期(26～36h)和衰亡期(38～44h)。32～34h時，細胞數(shù)量達到最大值；同時，在50 mg·L^-1Cu²⁺溶液中測定不同生長期P．putida 5一X細胞的吸附重金屬離子的能力，見圖3．當細胞進入對數(shù)生長期時，對Cu²⁺的吸附能力逐漸降低，在24～26h時達到最低值24．8mg·L^-1。．當細胞進入穩(wěn)定生長期，對Cu²⁺的吸附能力逐漸升高，并在穩(wěn)定生長期的后期加速上升．在穩(wěn)定期的末期，P．putida 5一X對Cu²⁺的吸附能力達到最大值67．7mg·L^-1。，在衰亡期細胞吸附能力再次降低．
表2 不同的營養(yǎng)限制對P．putida 5．x細胞生長和Cu²⁺吸附容量的影響
Table 2 Effect of nutrition limitation on cell growth and adsorption capability of P．putida 5一x

培養(yǎng)基 Cu²⁺吸附能力（mg·l^-1） 細胞生長情況（OD₆₀₀） 無營養(yǎng)限制培養(yǎng)基 49 5.80 氨限制培養(yǎng)基 63 2.09 硫限制培養(yǎng)基 67 5.65 磷限制培養(yǎng)基 47 4.95 葡萄糖限制培養(yǎng)基 44 2.55

　　 細胞吸附重金屬的能力與細胞表面結(jié)構(gòu)和組成有關(guān)^［13,14］．細胞表面組分中的脂多糖、蛋白質(zhì)、肽聚糖和膦酸脂等都含有帶負電荷的基團，如羰基、磷酸基和羥基等，都有利于吸附重金屬^[15]．不同生長期的細胞表面組成不同，帶有負電荷的基團的數(shù)量不同，因而吸附能力不同．在衰亡期，由于細胞自溶引起表面結(jié)構(gòu)破壞，故吸附能力顯著下降．
　　考慮到細胞產(chǎn)量和吸附能力，最佳收獲期在培養(yǎng)36h左右．故本實驗所用細胞均取自培養(yǎng)36h的培養(yǎng)液．

2．3 細胞預(yù)處理對Cu²⁺吸附的影響
　　使用不同的洗液對P．putida 5-x細胞進行預(yù)處理，與未進行預(yù)處理的細胞對比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)稀酸或(NH₄)₂SO₄ 洗滌后，細胞吸附Cu²⁺的能力提高11％～26％，而使用堿液或濃酸液洗滌，細胞吸附Cu²⁺的能力降低，見表3．實驗結(jié)果表明0．1～0．3 mo1·L^-1 HC1是最佳細胞預(yù)處理劑.

表3 預(yù)處理對細胞銅離子吸附容量的影響
Table 3 Effect of pretreatment on cell Cu adsorption capability

洗滌液 吸附容量（mg·g^-1） 增長比率（％） 新鮮細胞 67.3 0.1mol·L^-1 HCL 83.6 24.1 0.2mol·L^-1 HCL 83.4 23.9 0.3mol·L^-1 HCL 84.7 25.7 0.4mol·L^-1 HCL 77.2 14.7 0.6mol·L^-1 HCL 57.1 -15.1 0.1mol·L^-1 H₂SO₄ 78.3 16.2 0.3mol·L^-1 H₂SO₄ 49.6 -26.3 0.6mol·L^-1 H₂SO₄ 43.8 -34.9 10%(NH₄)₂SO₄ 74.9 11.3 15%(NH₄)₂SO₄ 76.2 13.2 0.1mol·L^-1 NaCl 51.6 -23.3

　　吸附實驗顯示，新鮮細胞和0．3mol·L^-1 HC1預(yù)處理的細胞對Cu²⁺的吸附過程可以分別用公式Q_p= 26．9Ce^0.75和Q_f=12．8Ce^0.68 表示，見圖4，這表明新鮮細胞和預(yù)處理細胞對Cu²⁺的吸附符合Freundlich吸附等溫線方程Q=Kf·Ceⁿ，因此這一吸附過程是一個物理吸附過程．公式中Kf值代表了吸附劑的吸附能力^[18]，預(yù)處理細胞的Kf值為26．9，遠大于新鮮細胞的Kf值12．8，也表明預(yù)處理細胞對Cu²⁺來說是一種比新鮮的P．putida 5-x細胞更好的吸附劑．

　　 通過透射電鏡(TEM)觀察，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)預(yù)處理的細胞表面有一結(jié)構(gòu)松散層(圖5a)，經(jīng)0．3mol·L^-1HC1處理后，該松散層被降解(圖5b)．細菌表面莢膜的含水率高達95％，由單層或多層糖和蛋白質(zhì)組成．由于含水量高，莢膜中的這些聚合物很容易變形并向外伸展出幾百nm，完全處于水中，很容易被洗滌液洗脫^[16]．用0.3mol·L^-1HC1進行預(yù)處理以去除細菌表面的莢膜結(jié)構(gòu)，可以使細胞外膜和肽聚糖層上的大量負電荷基團充分和Cu²⁺結(jié)合，從而提高對Cu²⁺離子的吸附能力．透射電鏡分析表明，P．putida 5-x細胞經(jīng)酸預(yù)處理后細胞表面結(jié)構(gòu)松散的莢膜被降解，從而提高了P．putida 5-x吸附Cu²⁺的能力．用堿液或濃酸處理會徹底破壞細胞表面結(jié)構(gòu)和成分從而使吸附能力降低．

　　理論上，莢膜中的糖和蛋白質(zhì)都含有帶負電荷的羰基和羥基，有利于與重金屬結(jié)合成鍵，但由于電荷密度低，成鍵作用有限．Cu²⁺為二價離子，需2個帶負電荷的吸附基團與之成鍵，由于細菌莢膜的含水量高導(dǎo)致其易變型，成鍵易引起莢膜表面構(gòu)造發(fā)生變化^[17]，造成在細胞外膜和肽聚糖層上的一些可以結(jié)合Cu²⁺的位點(電荷密度遠高于莢膜中)無法結(jié)合Cu²⁺離子(圖6)．因此，用0.3mol·L^-1HC1進行預(yù)處理以去除細菌表面的莢膜結(jié)構(gòu)，可以使細胞外膜和肽聚糖層上的大量負電荷基團充分和Cu²⁺結(jié)合，從而提高對Cu²⁺離子的吸附能力．當用堿液或濃酸處理會徹底破壞細胞表面結(jié)構(gòu)和成分，使吸附能力降低．
2．4 組合生物處理系統(tǒng)對廢水中Cu 的去除
　　組合生物處理系統(tǒng)中的半連續(xù)生物吸附裝置用于去除廢水中的Cu²⁺．收集在硫限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h的P．putida 5-x細胞(干重為0．2g)，使用0.3mol·L^-1HC1預(yù)處理后的菌體作為生物吸附劑，經(jīng)5次吸附一再生一吸附循環(huán)使用．含不同濃度Cu²⁺的城市污水經(jīng)生物吸附裝置處理后的結(jié)果，見表4。5次吸附循環(huán)中該生物吸附劑對不同濃度Cu²⁺的吸附率都在95％左右，處理后廢水中的Cu²⁺濃度降低到0．46～1．27mg·L^-1，表明經(jīng)過優(yōu)化條件制備的P．putida 5-x細胞對Cu 的吸附能力增強，再生4次后的吸附效果基本保持不變．細胞的再生回用可以減少吸附劑用量從而減少污泥量和運輸費用，降低了生物吸附的成本．因此該生物吸附劑是一種適合于實際應(yīng)用的優(yōu)良的Cu 吸附劑。

表4 組合生物處理系統(tǒng)中的生物吸附部分的運行結(jié)果
Table 4 Results of bio-adsorption of combined bio-proc es

原水中Cu²⁺的含量（mg·L^-1） 吸附后出水中Cu²⁺的含量（mg·L^-1） 平均去除率（％） 備注 30.4±1.3 1.27±0.28 95.8 V_原水=600ml 20.3±1.7 1.02±0.21 94.9 m_{生物吸附氧}=1.0g 10.7±1.1 0.46±0.13 95.7

1)所有數(shù)據(jù)均為5次吸附一再生循環(huán)過程中的平均值
2．5 Cu²⁺濃度對活性污泥過程去除COD的影響
　　活性污泥處理過程中，有機物必須先吸附在活性污泥上，才能被微生物降解，因此活性污泥對COD 吸附能力下降，必將影響其對COD的降解效率．COD吸附容量(CAC)可以用來評價活性污泥吸附有機物的能力，CAC可定義為活性污泥和有機廢水接觸前5 min內(nèi)廢水中C0D的減少(因為生物降解過程是一個較緩慢的過程，前5
min的COD下降主要是活性污泥對廢水中的COD吸附效應(yīng)所致)．污水中重金屬離子的濃度較低時，一般不會對微生物細胞中的降解酶產(chǎn)生抑制，但由于重金屬離子強烈的吸附競爭作用，活性污泥對有機物的吸附速率和能力仍將受到影響^[18]。
　　圖7表示的是污水中不同濃度的Cu²⁺對活性污泥CAC值和COD去除能力的影響．隨著污水中Cu²⁺濃度升高時，活性污泥的CAC值顯著降低．經(jīng)生物吸附后，原水中Cu²⁺濃度由10 mg·L^-1，20mg·L^-1，30mg·L^-1分別降低到0．46mg·L^-1，1．02mg·L^-1，1．27mg·L^-1．相應(yīng)地，活性污泥的CAC值(COD)由44．2mg·g^-1，35．7mg·g^-1，24．6mg·g^-1，44．2mg·g^-1升高為89．5mg·g^-1，81．8mg·g^-1，78．9mg·g^-1(圖7)．盡管生物吸附后活性污泥的CAC值比未吸附時升高，但是與不含Cu²⁺的相比，還是低了8％ ～18％．當污水中Cu²⁺濃度為10mg·L^-1，20mg·L^-1，30mg·L^-1時，COD去除率分別為74．4％，66．8％，57．9％．但生物吸附處理后，污水中Cu²⁺的濃度大大降低，SBR的COD去除率提到92％左右，和處理不含Cu²⁺時的去除率基本一致．這些結(jié)果表明，生物吸附后污水中的微量Cu²⁺依然對活性污泥的CAC存在影響，但對COD
去除率不再有顯著抑止作用．進一步說明，微量的Cu²⁺對微生物細胞的代謝酶無毒害作用，但對有機物在活性污泥菌膠團表面的吸附競爭仍然存在．這種競爭雖然對活性污泥吸附有機物不利，但對SBR工藝去除COD已基本沒有影響，尤其當水力停留時間(HRT)較長時(HRT>>5min)影響甚微^[18]．實驗結(jié)果說明，使用P．putida 5-x細胞作為生物吸附劑去除污水中的Cu²⁺以提高污水的可生化性是相當有效的．

　　將該組合生物處理系統(tǒng)與單獨的SBR工藝對比，各自處理含Cu²⁺的有機廢水的結(jié)果見表5．結(jié)果顯示，組合生物處理系統(tǒng)處理后出水中的Cu²⁺和C0D濃度遠低于單一SBR法．說明使用生物吸附一生物降解組合處理系統(tǒng)可以有效處理含重金屬離子的城市污水．

表５　組合生物處理系統(tǒng)與單一SBR的比較/mg·L^-1
Table5 Comparition of combined bio-process and SBR/mg·L^-1

工藝 入水 出水 Cu²⁺ COD Cu²⁺ COD 組合工藝 30.3±2.1 811±31 0.87±0.18 92.1±8 單一SBR工藝 30.3±2.1 811±31 21.8±4.43 341±37 組合工藝 20.8±1.3 820±33 0.76±0.17 67±7 單一SBR工藝 20.8±1.3 820±33 15.6-2.43 272+31 組合工藝 10.8±1.1 817±27 0.37+0.1 61+7 單一SBR工藝 10.8±1.1 817±27 7.93±1.27 209±17

3 結(jié)論
　　采用生物吸附一SBR組合的處理工藝可有效處理含Cu²⁺的城市污水．P．putida 5一x菌體經(jīng)硫限制培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在培養(yǎng)36h后收集，經(jīng)0．1～0．3mol·L^-1 HC1洗滌后作為生物吸附劑，可得到最佳吸附效果．透射電鏡分析指出，酸洗預(yù)處理由于去除了細胞莢膜，提高了細胞對Cu²⁺的吸附能力．新鮮細胞和酸預(yù)處理細胞對Cu²⁺的吸附過程是物理吸附過程，遵從Freundlich吸附等溫線．經(jīng)P．putida 5一x細胞的生物吸附處理后，污水中Cu²⁺濃度降到微量級，對SBR去除COD已無明顯影響，但對菌膠團吸附有機物尚存在較明顯的吸附競爭．與單獨SBR相比，組合生物處理系統(tǒng)更適合處理含重金屬離子的城市污水．

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