人工介質(zhì)富集微生物對藻類和藻毒素降解試驗(yàn)研究

紀(jì)榮平¹,李先寧¹,呂錫武¹,朱光燦¹,張立將²,趙傳鵬²,浦躍樸²
（1.東南大學(xué)環(huán)境工程系，江蘇南京，210096；2.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京，210009）

摘要：采用人工介質(zhì)富集微生物對藻類和藻毒素的生物降解進(jìn)行了試驗(yàn)研究。中試結(jié)果表明：在水力停留時間6～7d，源水葉綠素-a為15.3~266.1μg/L條件下，人工介質(zhì)對葉綠素-a的去除率達(dá)59.4%。運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）對藻毒素進(jìn)行了檢測，當(dāng)進(jìn)水總藻毒素TMC-RR和TMC-LR分別為0.25~8.9μg/L、1.04~4.7μg/L，胞外藻毒素EMC-RR和EMC-LR分別為0.13~0.17μg/L、0.02~0.11μg/L時，人工介質(zhì)對總藻毒素TMC-RR、TMC-LR和胞外藻毒素EMC-RR、EMC-LR平均去除率分別為47.9%、96.8%、41.5%、77%。PCR電泳圖譜發(fā)現(xiàn)人工介質(zhì)上富集有大量的假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。通過人工介質(zhì)富集微生物的方法可有效降解太湖水體中的藻類和藻毒素。

關(guān)鍵詞：人工介質(zhì)；溶藻細(xì)菌；假單胞菌屬；芽孢桿菌屬；藻毒素；生物降解

Study on biological degradation of algae and microcystins through the use of enrichment microbes by Artificial Medium

Ji Rongping¹，Li Xianning¹，Lv Xiwu¹，Zhu Guangcan¹，Zhang Lijiang²，Zhao Chuanpeng²，Pu Yuepu²

¹Department of Environmental Engineering，Southeast University,Nanjing 210096,China

²College of Public Health, Southeast University,Nanjing 210009,China

Abstract: Biological degradation of algae and microcystins（MCs） through the use of enrichment microbes by Artificial Medium was studied. The result showed that when chl-a in Taihu Lake was 15.3~266.1μg/L, 59.4% of Chl-a was removed within 6~7 days. High performance liquid chromatography （HPLC） analysis for detection of MCs was applied. When total microcystin RR and LR （TMC-RR and TMC-LR）、extracellular microcystin RR and LR （EMC-RR and EMC-LR） were 0.25~8.9、1.04~4.7、0.13~0.17、0.02~0.11μg/L in source water, average removal rates of TMC-RR、TMC-LR、EMC-RR、EMC-LR were 47.9%、96.8%、41.5% and 77% respectively. PCR electrophoresis chart finded that much algae-lysing bacteria as Bacillus.spp.and Pseudomonas.spp. were on the Artificial Medium. Algae and microcystin in the Lake Taihu caught be effectively degraded by enrichment microbes on the Artificial Medium.

Key words: Artificial Medium; algae-lysing bacteria; Bacillus.spp.; Pseudomonas.spp.; microcystin; biological degradation

0 前言

　　由于工業(yè)的高速發(fā)展，城市化進(jìn)程的加快，工業(yè)廢水和城鎮(zhèn)生活污水的超標(biāo)排放，特別是大量營養(yǎng)物質(zhì)的排入，使太湖富營養(yǎng)化不斷加重，全湖出現(xiàn)富營養(yǎng)化，局部水域出現(xiàn)有機(jī)污染和重富營養(yǎng)。富營養(yǎng)化引起藻類大量繁殖，其代謝物是飲用水消毒副產(chǎn)物的重要前體物，是飲用水處理中生物穩(wěn)定性的不安定因素，尤其是許多藻類產(chǎn)生毒素，而傳統(tǒng)制水工藝不能有效去除富營養(yǎng)化原水中的藻類和藻毒素，某些單元還可能引起藻細(xì)胞破裂，使水中溶解性藻毒素濃度增加，降低了飲水安全性^[1]。因此尋求能有效去除源水中藻毒素的處理方法，對保障居民飲用水健康具有十分重要的意義。
　　研究表明生物處理是藻毒素轉(zhuǎn)化的主要途徑。微囊藻毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被真核生物和細(xì)菌肽酶分解，但由于其分子的Adda基團(tuán)有不飽和雙鍵，易被天然水體中某些特殊細(xì)菌降解而降低毒性^[2]。有研究發(fā)現(xiàn)：水體中一些細(xì)菌和微小動物對藻類及其有毒副產(chǎn)品的生物降解起著十分重要的作用^[3]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種溶藻細(xì)菌、藍(lán)藻嗜菌體和真菌能裂解藻類營養(yǎng)細(xì)胞或破壞細(xì)胞的某一特定結(jié)構(gòu)^[4～7]。有人通過試驗(yàn)確證了自然水體中利用細(xì)菌等生物種屬降解藻毒素的可能性，但自然降解速度較慢^[8~9]。國內(nèi)的研究大多著重于生物預(yù)處理對水廠進(jìn)水中藻毒素的去除效果，而對人工介質(zhì)富集湖水中土著微生物的除藻和去除藻毒素的研究還未見報道。

1 試驗(yàn)裝置與分析方法

1.1 試驗(yàn)裝置
　　試驗(yàn)在太湖梅梁灣現(xiàn)場進(jìn)行，試驗(yàn)裝置分3格，每格長6m，寬1.2m，深1.8m，每格內(nèi)安裝1種人工介質(zhì)，分別記為RZ、RT、RW。試驗(yàn)裝置于2004年4月初通水，采用自然富集培養(yǎng)生物的方法進(jìn)行掛膜。通過生物量和生物活性的比較，確定人工介質(zhì)RZ為最優(yōu)，下面主要討論人工介質(zhì)RZ對藻類和藻毒素的凈化效果，其他兩種人工介質(zhì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)略。試驗(yàn)裝置流程見圖1。

圖1 試驗(yàn)裝置工藝流程圖

1.2 分析項目和方法
1.2.1 水質(zhì)分析項目有：葉綠素a、總藻毒素、胞外藻毒素。
1.2.2 葉綠素a的測定方法：采用0.45μm醋酸纖維濾膜過濾，用90%丙酮萃取，低溫避光靜置24h后用752N型紫外可見分光光度計測定在630nm、645nm、663nm、750nm四個波長下的吸光值，按公式計算葉綠素a含量^[10]。
1.2.3 藻毒素測定方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。
　?。?）水樣預(yù)處理：總藻毒素（TMC）檢測水樣：取500mL水樣按5％比例加入冰醋酸，混勻過夜。用0.45µm whatman GF/C玻璃纖維膜過濾，濾液備用。胞外藻毒素（EMC）檢測水樣：取1L水樣直接用0.45µm微孔濾膜過濾，濾液備用。
　?。?）水樣中MC的富集凈化：向已預(yù)處理的Superco C18固相萃取（SPE）柱中通入預(yù)處理后的水樣，過柱速度為5mL/min；依次用40mL去離子水、20mL10％甲醇、20mL20％甲醇淋洗吸附了水樣的C18 SPE柱，以盡量除去MC之外的雜質(zhì)。
　　（3）MC的洗脫與定容：用5mL含0.1％三氟乙酸（TFA）的純甲醇（色譜醇）分3次洗脫C18 SPE柱，將MC洗脫溶出于5mL帶刻度的錐底管中；將錐底管置于45℃的水浴鍋中，吹入凈化的空氣（經(jīng)兩層0.22µm微孔濾膜過濾），直至蒸發(fā)至約0.2mL，用含0.1％三氟乙酸（TFA）的純甲醇定容至0.4mL；將定容后的樣品用0.45µm的針頭過濾器過濾，濾液裝入樣品瓶，-20℃保存待測。
　　（4）HPLC檢測：采用Agilent 1100 高效液相色譜（HPLC）儀。主要配置：在線真空脫氣機(jī)，四元混合泵，自動進(jìn)樣器，光電二極管陣列檢測器（DAD），色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（Agilent,5µm,4.6×150mm），流動相：甲醇及0.05%TFA水溶液進(jìn)行梯度洗脫；流速：1mL/min；波長：238nm；加樣量：20µL；柱溫：40℃；標(biāo)樣：MC-LR，MC-RR（日本和光純藥工業(yè)株式會社），分子量分別為995.17，1038.21。
1.2.4 PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）檢測：分別從裝置中的人工介質(zhì)上取單位質(zhì)量的生物膜，保存于磷酸鈉緩沖液（0.12M，pH8.0），－20℃?zhèn)溆?。將采集到的人工介質(zhì)在無菌條件下剪碎并放置于PBS溶液中，渦流振蕩15min，超聲15min，過濾。4500r/min離心15min，收集下層菌體沉淀。采用酚－氯仿法提取細(xì)菌總DNA，使用假單胞菌、芽孢桿菌的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工介質(zhì)RZ對藻類的凈化效果
　　葉綠素-a是植物光合作用中的重要光合色素。通過測定浮游植物葉綠素，可了解人工介質(zhì)對藻類的去除狀況。試驗(yàn)期間（2004年4月～8月）源水葉綠素-a為15.3~266.1μg/L，出水為2.81~142.3μg/L，人工介質(zhì)RZ對Chl-a的平均去除率為59.4％，詳見圖2和表1，除“水華”爆發(fā)期（8月4日至8月18日）外，其余時間出水葉綠素-a均小于20μg/L。

圖2 人工介質(zhì)RZ對葉綠素-a去除效果

2.2 人工介質(zhì)RZ對藻毒素的凈化效果
　　人工介質(zhì)RZ對總藻毒素（TMC-RR和TMC-LR）、胞外藻毒素（EMC-RR和EMC-LR）平均去除率分別為47.9％、96.8％、41.5％、77.0％，詳見表1，可見藻毒素-LR的生物可降解性較好，去除率較高，而藻毒素-RR的生物降解性能相對較差。藻毒素-LR被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的肝臟腫瘤促進(jìn)劑，而它的可生物降解性較好，這對于控制飲用水中藻毒素濃度具有積極的意義。當(dāng)進(jìn)水藻濃度較高時，出現(xiàn)了出水藻毒素-RR濃度高于進(jìn)水濃度的現(xiàn)象，可能是裝置內(nèi)高濃度的藻類釋放出較多的藻毒素，而人工介質(zhì)未能及時有效降解的緣故。當(dāng)藻濃度較高時，出水胞外藻毒素-RR超過0.5μg/L，但藻毒素-LR<0.5μg/L。

人工介質(zhì)RZ對藻類和藻毒素的凈化效果　　　　　 表1

2.3 人工介質(zhì)對溶藻細(xì)菌的富集效果
　　首先應(yīng)用PCR技術(shù)對太湖梅梁灣地區(qū)水體細(xì)菌相進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了溶藻細(xì)菌－銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginosa）和芽孢桿菌屬（Bacillus.spp）的存在，表明通過人工介質(zhì)對特定溶藻細(xì)菌進(jìn)行有效富集是可行的。其次在運(yùn)行3個月后的3種人工介質(zhì)上均發(fā)現(xiàn)有假單胞菌屬（Pseudomonas.spp）和芽孢桿菌屬（Bacillus.spp）的富集，其中介質(zhì)RZ與介質(zhì)RT對芽孢桿菌屬（Bacillus.spp）的富集效果較介質(zhì)RW明顯；中層（水深0.9m）樣本的含量較上層（水深0.0m）和下層（水深1.8m）樣本多，詳見圖3。介質(zhì)RT與介質(zhì)RW對假單胞菌屬（Pseudomonas.spp）的富集效果較介質(zhì)RZ明顯，同樣是中層樣本的含量較上層和下層樣本多，下層樣本含量最低，詳見圖4，這與下層的生物量和生物活性都較低是一致的，下層接近底泥，溶解氧較低，不利于溶藻細(xì)菌的生長繁殖。至于中層樣本溶藻細(xì)菌較高的原因，可能與藻類在上升過程中首先被中層人工介質(zhì)吸附，為溶藻細(xì)菌的生長繁殖提供了基質(zhì)，關(guān)于溶藻細(xì)菌的溶藻機(jī)理，還須做進(jìn)一步的研究。

圖3 人工介質(zhì)富集芽孢桿菌屬效果比較　　　　　 圖4 人工介質(zhì)富集假單胞菌屬效果比較

3 結(jié)論

　?。?）人工介質(zhì)富集微生物對藻類和藻毒素降解試驗(yàn)研究表明，人工介質(zhì)對Chl-a平均去除率達(dá)60％左右，對藻毒素-RR（包括總藻毒素和胞外藻毒素）的去除率為41～48％，藻毒素-LR的去除率為77～97％，當(dāng)藻濃度較高時，出水胞外藻毒素-LR<0.5μg/L。通過利用人工介質(zhì)富集湖水中土著微生物的方法可有效降解太湖水體中的藻類和藻毒素。
　　 （2）應(yīng)用PCR技術(shù)對梅梁灣地區(qū)水體細(xì)菌相分析發(fā)現(xiàn)：天然水體中有溶藻細(xì)菌的存在，并在3種人工介質(zhì)上均有假單胞菌屬（Pseudomonas.spp）和芽孢桿菌屬（Bacillus.spp）的富集，其中人工介質(zhì)RZ的富集效果較其他兩種介質(zhì)明顯；中層樣本的細(xì)菌含量較上層和下層樣本含量多。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chow C W K,Drikas M,House J,et al.The impact of convertional water treatment process on cells of the cyanobacterium microcystis aeruginosa[J].Wat. Res.,1999,33（15）:3253~3262
[2] Tsuji K T,Watanuki T.Stability of microcystins from cyanobacteria-IV.Effect of chlorination on decomposition[J].Toxicon,1997,35（7）:1033~1041
[3] 呂錫武，稻森悠平，丁國際.有毒藍(lán)藻及藻毒素生物降解的初步研究[J].中國環(huán)境科學(xué)，1999，19（2）：138～140
[4] 彭超，吳剛，席宇等.3株溶藻細(xì)菌的分離鑒定及其溶藻效應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué)研究，2003，16（1）：37～40
[5] 郭亞新，程凱，趙以軍等.淡水噬藻體及其他溶藻因子的分布與感染力[J].中國環(huán)境科學(xué)，2003，23（2）：167～170
[6] Takenaka S,Watanabe M F.Microcystin LR degradation by Pseudomonas aeruginosa alkaline protease[J].Chemosphere,1997,34（4）:749~757
[7] Miller M J,Fallowfield H J.Degradation of cyanobacterial hepatotoxins in batch experiments[J].Wat.Sci.Tech.,2001,43（12）:229~232
[8] Cousins I T,Bealing D J,James H A,et al.Biodegradation of microcystin-LR by indigenous mixed bacterial populations[J].Wat. Res.,1996,30（2）:481~485
[9] 金麗娜，張維昊，鄭利等.滇池水環(huán)境中微囊藻毒素的生物降解[J].中國環(huán)境科學(xué)，2002，22（2）：189～192
[10] 國家環(huán)境保護(hù)總局編.水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002，670~671

課題來源：科技部“十五”重大科技專項（863計劃） 編號：2002AA601011－03
作者簡介：紀(jì)榮平（1965—）男，江蘇寶應(yīng)人，副教授，在職博士生，主要研究方向?yàn)樗幚砝碚摷肮こ碳夹g(shù)。
E-mail：rpji2002@sina.com