李軍　　　　　 聶梅生　　　　　　　　　　　　　　 王寶貞　　　　　　　　 趙琦
（北京工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院）（哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院）（首都師范大學(xué)生物系）

　　前言

　　水體的富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象已成為人類所面臨的嚴(yán)重的水環(huán)境問(wèn)題之一，降低廢水中的氮尤其是磷含量是防止水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要任務(wù)。填料載體上生物膜是處理系統(tǒng)發(fā)揮作用的主體，研究序批式除磷反應(yīng)器中生物膜的特性和主要微生物組成、探討究竟是哪些微生物在生物膜除磷過(guò)程中起主要作用，是探明序批式生物膜除磷機(jī)理的重要課題。

　　1　序批式生物膜除磷反應(yīng)器中生物量的測(cè)定

　　1.1測(cè)定方法
　?。?）從筆者穩(wěn)態(tài)試驗(yàn)運(yùn)行的序批式生物膜法除磷反應(yīng)器中^［1］取出有代表性的填料，將填料放入容器中加入一定量的蒸餾水搓洗，把含洗脫膜的水轉(zhuǎn)入2000ml量筒中，重復(fù)搓洗3-5次，直至填料上的膜全部洗脫下來(lái)而填料變成白色為止，再往盛洗脫膜的量筒中加蒸餾水至滿刻度；
　?。?）取混勻的洗脫液200ml，測(cè)定103℃-105℃烘干的總殘?jiān)蝗』靹虻南疵撘?00 ml，用定量濾紙抽濾，然后取所得濾液，測(cè)定103℃-105℃烘干的總可濾殘?jiān)?，得懸浮固體M_S’=總殘?jiān)?總可濾殘?jiān)?br> 　?。?）把經(jīng)過(guò)（2）測(cè)得的總殘?jiān)涂偪蔀V殘?jiān)謩e在550℃的馬福爐中灼燒30分鐘，取出在干燥器內(nèi)冷卻后稱量至恒重，得總殘?jiān)涂偪蔀V殘?jiān)淖茻龤堅(jiān)?，則揮發(fā)性懸浮固體M_VS’=（總殘?jiān)?總殘?jiān)淖茻龤堅(jiān)?（總可濾殘?jiān)?總可濾殘?jiān)淖茻龤堅(jiān)?br> 　　（4）在取走填料的反應(yīng)器中立即取混合液200ml，同步驟2）、3）分別測(cè)出反應(yīng)器中混合液的懸浮固體M_S”和揮發(fā)性懸浮固體M_VS”，則得反應(yīng)器中懸浮固體M_S和揮發(fā)性懸浮固體M_VS的計(jì)算公式：

　　

　　反應(yīng)器中MLVSS和MLSS的表達(dá)式：MLSS＝1000 M_S/V （mg/l）
　　MLVSS＝1000 M_VS/V（mg/l）
　　　式中：M_Sｉ’－第ｉ種代表性填料的懸浮固體，g
　　　　　　M_VSｉ’－第ｉ種代表性填料的揮發(fā)性懸浮固體，g
　　　　　　N_ｉ －第ｉ種代表性填料相同或相似的填料數(shù)
　　　　　　ｎ －代表性填料的種類數(shù)
　　　　　　M_S”－混合液的懸浮固體，g
　　　　　　M_VS” －混合液的揮發(fā)性懸浮固體，g
　　　　　?。?－反應(yīng)器容積，ｌ
　　1.2　測(cè)定過(guò)程及結(jié)果
　　將所取代表性填料分成上、下兩段，每段長(zhǎng)度均為55cm，然后把每段作為單獨(dú)的有代表性的填料，按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)器中有８根相同填料，結(jié)果如表１。

表１ SBR生物膜反應(yīng)器中生物量測(cè)定結(jié)果 填料位置 M_si’
(g) M_vsi’
(g) M_vsi’/M_si’
(%) 反應(yīng)器混合液
(g) 總SS
(g) 總VSS
(g) MLSS
(mg/l) MLVSS
(mg/l) 上部 1.2423 0.8125 65.40 M_S”=0.002965
M_VS”=0.001425 194.8072 121.6928 8854.9 5531.7 下部 1.5360 0.9238 60.14

　　由表１知，SBR生物膜反應(yīng)器中生物量非常大，超過(guò)淹沒(méi)式軟填料生物膜工藝^［2］、SBR除磷活性污泥系統(tǒng)^［3］和A²/O活性污泥系統(tǒng)中的生物量^［4］，反應(yīng)器中上部生物膜活性高于下部。

　　2　生物膜污泥產(chǎn)率及污泥含磷量

　　2.1污泥產(chǎn)率
　　由于SBR生物膜除磷工藝的特殊性，可較方便地測(cè)出運(yùn)行一個(gè)周期后的污泥產(chǎn)量。在進(jìn)水負(fù)荷為１.00kgCOD/m³/d時(shí)，將一周期后脫落的污泥取出，過(guò)濾后于103℃-105℃烘干，稱得MLSS＝1.0733g，產(chǎn)泥率為0.1996kg干泥/kgCOD，介于傳統(tǒng)生物膜法和傳統(tǒng)活性污泥法的產(chǎn)泥率之間，與以消化為目的延時(shí)曝氣活性污泥法的產(chǎn)泥率接近^［4］。
　　2.2污泥含磷量
　　準(zhǔn)確稱取污泥風(fēng)干樣品0.0744 g，在樣品上下各鋪一層NaOH于鎳坩堝中，將坩堝放在酒精噴燈上到樣品處于熔融狀態(tài)，用鐵夾將坩堝取出在水中急冷，用蒸餾水多次洗滌坩堝，用(1+1)H₂SO₄中和至pH<７，定容至1000ml^［5］。
　　將上述溶液再稀釋20倍后取50ｍl于比色管中，加入5ml鉬酸銨溶液混勻，加入0.25ml氯化亞錫溶液，充分混勻，室溫放置15min后，于700nm波長(zhǎng)處以零濃度空白為參比，測(cè)定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的含磷量為0.2108mg/l，污泥中磷含量為5.67%。

　　3　生物膜沉降特性

　　計(jì)時(shí)進(jìn)行靜止沉淀。把量筒中洗脫液混均,然后讓其進(jìn)行靜置沉淀，分別記下靜沉?xí)r間及污泥沉淀層容積. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，可見(jiàn)纖維填料上生物膜上、下部都具有良好的沉降性，有利于脫落生物膜沉淀，使出水水質(zhì)穩(wěn)定。

　　4　除磷微生物特性研究

　　4.1試驗(yàn)材料
　　生物膜樣品
　　本試驗(yàn)所用生物膜混合液取自筆者試驗(yàn)中穩(wěn)態(tài)運(yùn)行的序批式生物膜反應(yīng)器中填料載體上的生物膜^[1]。
　　檢樣1為生物膜反應(yīng)器除磷試驗(yàn)的前期（反應(yīng)器運(yùn)行第四個(gè)月）樣品，檢樣2為中期（反應(yīng)器運(yùn)行第六個(gè)月）樣品。
　　培養(yǎng)基
　　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂)。
　　4.2試驗(yàn)方法
　　（1）檢樣處理
　　無(wú)菌操作取出生物膜，測(cè)量表面積。檢樣1，0.2217 cm²；檢樣2，0.2165 cm²。然后用滅菌剪刀將生物膜剪碎，放入裝有滅菌生理鹽水玻璃珠的三角燒瓶中，充分振蕩，將生物膜上細(xì)菌洗下，以此生理鹽水懸液作為菌落總數(shù)測(cè)定，細(xì)菌計(jì)數(shù)按標(biāo)準(zhǔn)平板法進(jìn)行^[6]。
　　（2）菌落總數(shù)確定
　　將上述生理鹽水懸液進(jìn)行適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋，然后取各稀釋度懸液0.1ml進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，用滅菌“L”形玻璃棒將其涂布均勻，放入36℃溫箱中培養(yǎng)24h，然后連續(xù)觀察3天。
　?。?）菌相分析
　　取上述各稀釋度菌懸液0.1 ml加入普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，用“L”玻璃棒將涂布均勻的一組放在36℃溫箱培養(yǎng)，另一組放入?yún)捬豕拗校?6℃培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)72h，取出并觀察結(jié)果，選30－300個(gè)的平皿，進(jìn)行菌相分析，選取菌落形態(tài)一致的菌為一組菌，然后進(jìn)行革蘭氏染色，做八項(xiàng)常規(guī)試驗(yàn)和十項(xiàng)常規(guī)試驗(yàn)確定其為哪個(gè)菌屬的細(xì)菌。其中，八項(xiàng)常規(guī)試驗(yàn)包括：形態(tài)、動(dòng)力、需氧生長(zhǎng)、接觸酶、氧化酶、葡萄糖利用試驗(yàn)、OF試驗(yàn)，十項(xiàng)常規(guī)試驗(yàn)包括：抗酸染色、形態(tài)、芽孢試驗(yàn)、動(dòng)力、需氧生長(zhǎng)、厭氧生長(zhǎng)、接觸酶、氧化酶、葡萄糖利用試驗(yàn)、OF試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》所述的方法進(jìn)行^[7]。
　　4.3試驗(yàn)結(jié)果
　　（1）菌落總數(shù)

表1 菌落總數(shù) 檢樣1 檢樣2 稀釋度 10^-3 10^-4 10^-5 10^-4 10^-5 10^-6 菌落數(shù) >300 210 17 >300 127 14

　　由上表得出：檢樣1的菌落總數(shù)：2.52×10⁸個(gè)/ml
　　檢樣2的菌落總數(shù)：1.56×10⁹個(gè)/ml
　?。?）菌相分析結(jié)果
　　普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板在36℃下培養(yǎng)24h
　　需氧培養(yǎng)：檢樣1在10^-4稀釋度平板上長(zhǎng)出210株菌落
　　檢樣2在10^-5稀釋度平板上長(zhǎng)出127株菌落
　　厭氧培養(yǎng)：檢樣1、檢樣2均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)
　　菌相分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬，其次依順序?yàn)闅鈫伟鷮?、芽孢桿菌屬、微球菌屬、硝化桿菌屬。

表2 菌相構(gòu)成分析表 菌屬 檢樣1 檢樣2 菌群 菌相構(gòu)成比(%) 菌群 菌相構(gòu)成比(%) 假單胞菌屬 98 46.67 64 >50.39 氣單胞菌屬 70 33.33 36 >28.35 芽孢桿菌屬 34 16.19 18 >14.17 微球菌屬 6 2.86 5 >3.94 硝化桿菌屬 2 0.95 4 >3.15 合計(jì) 210 100 127 >100

　　4.4討論
　　4.4.1序批式生物膜反應(yīng)器不同運(yùn)行期生物比較
　?。?）細(xì)菌總數(shù)
　　在除磷試驗(yàn)的中期生物膜中細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)初期，約為初期的5倍，這是因?yàn)樯锬げ粩囫Z化培養(yǎng)后，逐步成熟的原因。
　?。?）菌相組成
　　由表2知，在運(yùn)行中期假單胞菌的構(gòu)成比例超過(guò)初期。同時(shí)，氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬的構(gòu)成比卻低于初期。這說(shuō)明，假單胞菌屬為本系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌屬，且隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，而更加穩(wěn)定。另外，硝化桿菌的比例在運(yùn)行中期也高于初期，說(shuō)明，隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，本系統(tǒng)的硝化功能趨于提高。
　　4.4.2與除磷工藝中活性污泥混合液菌相構(gòu)成比較
　　以往人們認(rèn)為不動(dòng)桿菌屬在活性污泥除磷過(guò)程中起著最主要的作用。但是，在本試驗(yàn)中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬。Hascoet^[8]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)行良好的間歇式生物脫氮除磷試驗(yàn)裝置的污泥混合液中幾乎找不到不動(dòng)桿菌，清華大學(xué)周溪岳^[3]、華東師范大學(xué)朱懷蘭^[9]的間歇式污泥除磷試驗(yàn)裝置中，也沒(méi)有找到不動(dòng)桿菌。此外，即使在一些裝置中，不動(dòng)桿菌屬相當(dāng)多，但它在除磷過(guò)程中所起的作用都不大。當(dāng)然由于所采取工藝、原水水質(zhì)、運(yùn)行條件不同，活性污泥混合液內(nèi)微生物組成和數(shù)量會(huì)有差異，但是這說(shuō)明了以往的廢水生物除磷主要是由不動(dòng)桿菌屬完成的觀點(diǎn)是不夠全面的。
　　另外，同樣是間歇式除磷工藝，本試驗(yàn)采用的序批式生物膜與序批式活性污泥的菌相構(gòu)成有相似也有不同，其比較見(jiàn)表3。由表3知，兩者最大的不同是在淹沒(méi)式生物膜除磷系統(tǒng)中有硝化桿菌屬，而序批式活性污泥系統(tǒng)中沒(méi)有。

表3 序批式生物膜與序批式活性污泥菌相構(gòu)成比較表 菌屬 生物膜菌相構(gòu)成比
(%) 菌屬 活性污泥^[3，9] 菌相構(gòu)成比(%) 1 2 假單胞菌屬 50.39 假單胞菌屬 51.3 44.6 氣單胞菌屬 28.35 氣單胞菌屬 芽孢桿菌屬 14.17 棒桿菌屬 25.1 21.5 微球菌屬 1.94 不動(dòng)桿菌屬 18.4 27.7 硝化桿菌屬 23.15 腸桿菌屬 1.1 6.2 合計(jì) 100 合計(jì) 100 100

　　4.4.3主要菌群的功能
　　Cloete等人^[10]的研究認(rèn)為，假單胞菌屬、氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬等都不僅能有效地降解有機(jī)物，而且能過(guò)量攝取廢水中的磷以聚磷酸鹽顆粒的形式貯存于細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)還能還原硝酸鹽進(jìn)行反硝化脫氮。另外芽孢桿菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬等，也具備上述功能，這與本試驗(yàn)研究是基本一致的。氣單胞菌的另一主要功能是發(fā)酵產(chǎn)酸作用，即在厭氧段將合成廢水中的蛋白質(zhì)之類的大分子物質(zhì)發(fā)酵成小分子的揮發(fā)性脂肪酸，而一般硝化桿菌的作用是進(jìn)行硝化。本試驗(yàn)在穩(wěn)定運(yùn)行期有很好的硝化以及去除COD、氮和磷的效果^[1，11]，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。
　　4.4.4細(xì)菌總數(shù)比較
　　本試驗(yàn)穩(wěn)定運(yùn)行期細(xì)菌總數(shù)為1.56×10⁹個(gè)/ml，是穩(wěn)定運(yùn)行期SBR活性污泥系統(tǒng)細(xì)菌總數(shù)(4.6×10⁸個(gè)/ml)的3倍多^[3]，從而使得序批式生物膜除磷系統(tǒng)從除磷菌數(shù)上更有利于除磷。

　　5　除磷生物膜生物相

　　5.1原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的特征
　　序批式生物膜反應(yīng)器從進(jìn)水到出水，有機(jī)物濃度變化很大，然而其中的微生物相卻比較穩(wěn)定，而且在數(shù)量上也沒(méi)有出現(xiàn)大起大落的情況。原生動(dòng)物主要為纖毛蟲(chóng)類，其中出現(xiàn)頻率最多的是固著型纖毛蟲(chóng)類，有鐘蟲(chóng)、累枝蟲(chóng)和蓋蟲(chóng)；其次是游泳型纖毛蟲(chóng)，有草履蟲(chóng)（主要在進(jìn)水時(shí)出現(xiàn)）、賢形蟲(chóng)和漫游蟲(chóng)。另外，生物膜中也有少量的綠眼蟲(chóng)和變形蟲(chóng)。生物膜中出現(xiàn)的后生動(dòng)物有線蟲(chóng)類、輪蟲(chóng)類、甲殼蟲(chóng)類等。甲殼蟲(chóng)動(dòng)物主要為水蚤類。
　　值得指出的是序批式反應(yīng)器生物膜上的生物相并沒(méi)有象傳統(tǒng)的生物膜法那樣，隨著從進(jìn)水到出水而改變，相反在整個(gè)處理過(guò)程中，象鐘蟲(chóng)、累枝蟲(chóng)、線蟲(chóng)等一致生長(zhǎng)良好，而且在數(shù)量上沒(méi)有出現(xiàn)大起大落，這些適于在低污染度條件下生活的微生物仍能存活，只是隨環(huán)境條件的改變，原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的形態(tài)也隨之變化，因此，在同一周期內(nèi)，淹沒(méi)式生物膜反應(yīng)器中的原生動(dòng)物和后生動(dòng)物種屬不宜用來(lái)指示水質(zhì)，而只能從原生動(dòng)物的形態(tài)來(lái)指示水質(zhì)。
　　5.2原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的作用
　　原生動(dòng)物可直接利用水中有機(jī)物質(zhì)，對(duì)水中有機(jī)物的凈化起一定的積極作用，更主要是原生動(dòng)物是以吃細(xì)菌為主，而后生生物是以細(xì)菌、小的原生動(dòng)物和有機(jī)顆粒等為食物，從而形成食物鏈和不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的消費(fèi)者生物，與反應(yīng)器環(huán)境形成一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。
　　細(xì)菌、原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的活性在好氧條件下要比無(wú)氧條件下大大提高，所以序批式生物膜除磷反應(yīng)器在從厭氧轉(zhuǎn)為好氧時(shí)，除磷菌的繁殖速度將大大加快，而原生動(dòng)物、后生動(dòng)物的捕食能力也逐漸增強(qiáng)，而這時(shí)被吞食的除磷菌大都是過(guò)量攝取了磷的細(xì)菌，因此，原生動(dòng)物、后生動(dòng)物在體內(nèi)富集了磷，而這些磷將隨同其死亡尸體轉(zhuǎn)入污泥，從而有利于提高序批式生物膜反應(yīng)器中脫落污泥的磷含量；其次，在好氧段由于原生動(dòng)物、后生動(dòng)物的活動(dòng)可軟化生物膜，促使生物膜松動(dòng)、脫落，并提高氧轉(zhuǎn)移率，從而能使生物膜保持經(jīng)?；钚院土己玫膬艋δ?，既有利于去除有機(jī)物也有利于除磷。

　　6　結(jié)論

　?。?）序批式生物膜除磷反應(yīng)器中，生物量大，MLVSS達(dá)5531.7mg/l；細(xì)菌總數(shù)多，為1.56×10⁹個(gè)/ml，從而為生物除磷在菌數(shù)上奠定了基礎(chǔ)。
　　（2）脫落污泥沉降性好、含磷量高，污泥產(chǎn)率為0.1996kg干泥/kgCOD。
　?。?）生物相穩(wěn)定，對(duì)序批式生物膜除磷工藝而言，原生動(dòng)物和后生動(dòng)物的種屬不宜用來(lái)指示水質(zhì)，而只能從原生動(dòng)物的形態(tài)指示水質(zhì)。
　?。?）序批式生物膜除磷工藝中優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬，其次依順序?yàn)闅鈫伟鷮?、芽孢桿菌屬、微球菌屬、硝化桿菌屬。

　　參考文獻(xiàn)

　　1　李軍、王寶貞、聶梅生, 序批式生物膜法除磷工藝試驗(yàn)研究，2001
　　2 Wang B., Li G., Yang Q. And Liu R, Nitrogen Removal by a Submerged Biofilm Process with Fibrous Carrier, Wat. Sci. Tech. ,1992，26(9-11), 2037-2089
　　3　周溪岳，廢水生物除磷機(jī)理及間歇式生物處理工藝的研究，清華大學(xué)博士論文，1990
　　4　蘭淑澄等，A²/O生物處理系統(tǒng)污泥特性的研究，北京市環(huán)境保護(hù)研究院，1994
　　5　國(guó)家環(huán)保局編，水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第三版），中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，1988
　　6　羅雪云主編，食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995
　　7　Krige.N.R., J.G.Holt etal. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1. London: Williams & Wilkins Baltimore,1986
　　8　Hascoet.M.C., et al. Biochemical Aspects of Enhanced Biological Phosphorus Removal from Wastewater. Wat.Sci.Tech., 1985, Vol.17, No.11/12
　　9　朱懷蘭，SBR除磷系統(tǒng)中的積磷細(xì)菌。給水排水技術(shù)動(dòng)態(tài)，1994，No.2
　　10　Cloete,T.E.and P.L.Steyn.The Role of Acinetobacter as a Phosphorus Removing agent in Activated Sludge . Wat.Res, 1988, Vol.22, No.8
　　11　Wang Baozhen and Li Jun, Simultaneous Phosphorus and Partial Nitrogen Removal by Submerged Biofilm SBR System，1st World Water Congress of the International Water Association (IWA)，2000, July